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染色方法有哪几种

点击次数:63 日期:2019/8/5 16:55:42

  

染色方法有哪几种

 

蛋白质-DNA染色法

  试剂  碘化丙啶100ug/ml,FITC  50ug/mlPBS-EDTA:含EDTA 174mg/mlPBSRNA1mg/1ml,需加热至90℃以上30分钟去除DNA酶。

   操作步骤  取70%冷乙醇固定的细胞(至少固定12小时以上)12×106/ml,离心,用PBS洗一次,加RNA100ul37℃消化30分钟。加1ml  PBS-EDTA液,及FITC20ul,混匀,避光,置室温中5分钟,加PI 1ml,混匀。避光,置室温中10分钟后上机测定。

吖啶橙(AO)染色法

    注意事项  所用AO必须是Polysciences CO。产品,AO浓度应在516ug/ml。推荐用以70%冷乙醇固定的小鼠胸腺细胞为标准样品。以确定不同型号FCM需用的最佳AO浓度。以RNA为横坐标,DNA为纵坐标时最佳图型应呈~型,上、下线应平行,不倾斜。凡测试标本前先以小鼠胸腺标本检验仪器状态。

   AO染液易污染管道,每次实验结束后需用漂白粉或清洁液冲洗管道,再用蒸馏水生理盐水长时间冲洗,以使AO染液冲洗净。

免疫抗体标记与DNA双染色法

    操作步骤  血或骨髓用比重为1.077g/ml淋巴细胞分层液分离单个核细胞。如分层后仍含有较多的红细胞,则可用0.83% NH4CI溶液,以3倍于细胞悬液量,15℃混匀15分钟。或用蒸馏水溶解30秒钟后立即加2倍量的1.8%生理盐水以去除红细胞。免疫标记的标本应含90%以上的活细胞。调整细胞浓度至1×107/ml。取50ul细胞悬液加第一抗体,混匀后置43060分钟。用PBS洗细胞2次。再加第二抗体,混匀后置4℃ 3060分钟再用PBS洗细胞2次,加入约1ml PBS,即可上机测定。或将细胞固定于2ml 70%冷乙醇或0.5%多聚甲醛。避光保存于4℃。荧光强度可保持10天不衰老减。标记后的新鲜细胞或固定细胞均可再用RNA100ul1mg/ml)于37℃中消化30分钟,加PI 1ml100ug/ml)混匀,10分钟后上机检测。

DNA与ras基因蛋白检测法

    取1.5×106细胞,固定于1ml 100%冷甲醇中,充分振摇后置于—20℃至少10分钟。离心沉淀,弃上清液。用不含钙、镁的HBSSPBS洗细胞一次,离心,弃上清液、留约50ul。再加50ul PBS(含1%牛血清白蛋白)及1%羊血清,混合后置室温中30分钟。加50ulras MoAb(用含1% BSAPBS198稀释)。混匀后,置冰上30分钟。用PBS洗两次。留约50ul上清液,加50ul FITC-兔抗大鼠抗体(该抗体需用PBS1:10稀释),混匀后,置冰上30分钟。用PBS洗两次,加250ul RNA酶(500u。/ml)混匀,置37℃避光保温30分钟,再加250ul PI50ug/ml)混匀,10分钟后上机测定。或可加第三抗体,即FITC标记的羊抗兔抗体,以增强FITC荧光强度。

PCNA与DNA双染色法

    1×106细胞,用1%多聚甲醛及20ug/ml Lysolecithin PBS 1ml固定2分钟。立即离心沉淀(5000rpm1分钟),弃上清液,轻轻振荡沉淀物。加100%甲醇1ml,置—205分钟,离心沉淀,弃上清液。加含0。1% NP40PBS  1ml,混匀,置冰上5分钟。加第一抗体200ulPCNAPBS 1:100稀释)。对照用Coulter IgG 5ulPBS 195ul,混匀,置室温10分钟。离心沉淀,加第二抗体FITC-羊抗鼠IgG  200ul混匀放置10分钟。离心沉淀,加PI 500ul50ul/ml),1000u  RNA酶,混匀后置室温20分钟后测定。

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